果樹(shù)種質(zhì)資源超低溫保存研究進(jìn)展

超低溫保存技術(shù)在果樹(shù)種質(zhì)資源保存中的應用及國內外研究進(jìn)展

摘要：超低溫保存是作物種質(zhì)資源離體保存的有效方法之一。本文概述了超低溫保存技術(shù)在果樹(shù)種質(zhì)資源保存中的應用及國內外研究進(jìn)展，對存在的問(wèn)題進(jìn)行了分析，并對其發(fā)展提出了建議。

關(guān)鍵詞：果樹(shù);種質(zhì)資源;離體保存

植物種質(zhì)超低溫保存是指在低于-196℃的低溫條件下對植物器官、組織或細胞進(jìn)行保存。在這樣的低溫條件下，植物材料的代謝和生長(cháng)活動(dòng)幾乎*停止，因此，能夠有效保持材料的遺傳穩定性，同時(shí)又不會(huì )喪失其形態(tài)發(fā)生的潛能。所以，這是一種不需要繼代的長(cháng)期保存植物種質(zhì)的，也是果樹(shù)品種改良和分子遺傳學(xué)研究的前提和基礎。

隨著(zhù)現代果品業(yè)的發(fā)展，種質(zhì)資源的重要性越來(lái)越被重視。1968年Quatran成功地保存了亞麻細胞，拉開(kāi)了 凍保存的帷幕。1973年Nag和Street超低溫保存胡蘿卜懸浮細胞獲得成這是植物種質(zhì)超低溫保存的報道，之后超低溫保存技術(shù)在植物種質(zhì)保存方面的研究和應用逐漸深入。

將超低溫保存技術(shù)與組織培養技術(shù)相結合，可以將大量的果樹(shù)種質(zhì)儲存在液氮罐中。這種保存形式的優(yōu)點(diǎn)是果樹(shù)的種質(zhì)保存不受土地、人力等條件的限制且取材方便、效率高、極大地節省開(kāi)支;此外，還可以避免種質(zhì)保存過(guò)程中的自然變異，保證種質(zhì)的遺傳穩定性，同時(shí)有利于種質(zhì)在間的交換。

1、材料的選擇

由于植物的基因型、抗凍性以及器官、組織和細胞的年齡、生理狀態(tài)等因素對超低溫保存效果有較大的影響，從而要求在整個(gè)保存處理過(guò)程中采取相應的符合其材料特性的各種措施。不同基因型的植物材料對超低溫保存的反應各不相同，凍后存活率的顯著(zhù)差異不僅存在于種間，也存 在于不同品系間。趙艷華等(1998)在包埋干燥超低溫保存蘋(píng)果離體莖尖時(shí)發(fā)現，材料的生理狀態(tài)對莖尖存活率的影響甚至比保存過(guò)程中處理 因素的影響更大。因此， 在進(jìn)行超低溫保存前，對材料的選擇十分重要?？梢赃M(jìn)行超低溫保存的材 料種類(lèi)很多，主要分為4類(lèi)：①莖尖和側生分生組織;②原生質(zhì)體;③懸浮培養物、愈傷組織和 體細胞胚;④其他植物器官，如胚、子房、花粉、 花藥、種子等。

2、超低溫保存種質(zhì)資源的研究進(jìn)展

2.1 超低溫保存技術(shù)在蘋(píng)果和梨中的研究進(jìn)展 邵建柱(2003)[11] 對蘋(píng)果等果樹(shù)種質(zhì)資源的 離體保存進(jìn)行了研究，通過(guò)對試管苗狀態(tài)的調整、外植體類(lèi)型及大小的選擇，結合密閉減少氧氣供應和水分蒸發(fā)，成功地建立了適合蘋(píng)果等果樹(shù)離體材料的常溫緩慢生長(cháng)法保存技術(shù)。確定了15個(gè)梨品種離體莖段培養物的通用繼代培養基，即MT+1.0mg/LBA+0.1mg/LNAA+2.0mg/LGA3，為梨的離體保存研究初步奠定了基礎。同時(shí)還完善了蘋(píng)果和梨離體莖段的常低溫保存技術(shù)，使得蘋(píng)果和梨離體莖段在(3±0.5)℃條件下，保存28個(gè)月和24個(gè)月后，仍保持近100%存活率。進(jìn)一步完善了蘋(píng)果莖段的超低溫保存技術(shù)，確立了甘油和ABA在預處理中的重要作用。

以蘋(píng)果離體莖尖為試材，對蘋(píng)果離體莖尖超低溫保存方法比較發(fā)現，包埋干燥法操作程序簡(jiǎn)單，存活率及再生率高，為佳的保存方法。

2.2超低溫保存技術(shù)在枇杷中的研究進(jìn)展

采用干凍化法對枇杷花粉超低溫 保存進(jìn)行了研究。結果表明：花粉的含水量是決定枇杷花粉超低溫保存成敗的關(guān)鍵因素， 30%左右的含水量能夠保證超低溫保存后花粉的活力;解凍溫度及方式對超低溫保存后花粉的存活力沒(méi)有明顯影響。

對經(jīng)過(guò)干燥脫水至不同含 水量的枇杷離體花粉進(jìn)行了超低溫(-196℃)保存試驗。結果表明：超低溫保存花粉時(shí)，花粉的含水量多寡是成敗的關(guān)鍵。對于枇杷而言，選擇含水量為13%左右的花粉比較合適?；ǚ墼谝旱?中保存2、8h和24h，其發(fā)芽率無(wú)顯著(zhù)差異。

2.3 超低溫保存技術(shù)在百合中的研究進(jìn)展

對百合莖尖玻璃化超低溫保存基本條件進(jìn)行了研究，發(fā)現前處理和解凍方 式是影響超低溫保存存活率的主要因素。

以百合試管苗莖尖分生組織為材料，對玻璃化法超低溫保存技術(shù)進(jìn)行了實(shí)驗研究，并通過(guò)正交設計試驗對影響超低溫保存存活率的主要影響因素(預培養基中蔗糖濃度、預培養時(shí)間和PVS2處理時(shí)間)進(jìn)行了分析，初步建立了百合種質(zhì)超低溫保存的佳技術(shù)方案。

2.4 超低溫保存技術(shù)在櫻桃中的研究進(jìn)展

櫻桃種質(zhì)資源的離體保存研究起步較晚，目前尚未見(jiàn)大規模離體保存庫建立的報道。Marthe對兩個(gè)櫻桃的中間砧進(jìn)行過(guò)液氮超低溫保存研究。Niino采用PVS2玻璃化液對5個(gè)甜櫻桃品種和2個(gè)櫻桃砧木進(jìn)行超低溫保存，試驗中所使用的玻璃化液中DMSO對材料具有毒害作用，高含量的蔗糖又會(huì )加劇材料的褐化，導致保存后 莖尖再生困難。趙艷華等(1999)對馬哈利櫻桃的超低溫保存研究發(fā)現PVS3的效果。 牛愛(ài)國在MS培養基中添加10g/L甘露醇可使試管苗保存7.5個(gè)月，母株存活率62%，繼代后成 活率83%。

2.5 超低溫保存技術(shù)在其它植物中的研究進(jìn)展

以離體培養的栗子莖尖為 材料，對超低溫保存過(guò)程中的影響因素進(jìn)行研究， 所有基因型的材料均獲得再生植株，有的高達38%～54%，建立了有效的超低溫保存程序。

對木瓜的超低溫保存技術(shù)進(jìn)行了研究，建立了率的超低溫保存的玻璃化程序：即在含有0.09mol/L蔗糖的MS培養基上繼代培養45～50d，然后轉移至2.0mol/L丙 三醇+0.4mol/L蔗糖的培養基中， 25℃下包埋處理60min;然后轉移至PVS2中， 0℃脫水處理80min，然后迅速投入液氮中，經(jīng)過(guò)解凍處理獲得90%的再生率，是一種的超低溫保存木瓜方法。

采用玻璃化法對草莓莖尖的離體超低溫保存進(jìn)行了初步研究。研究表明，預培養12d的莖尖存活率高，為82.4%;其次 為6d， 為77.8%;不經(jīng)預培養的差，為15.8%。不同品種的成活率和成苗率有差異，寶交早生的 成活率高于UC5，而寶交早生成活莖尖的成苗率(79%)低于UC5(100%)。

采用玻璃化法對荔枝 胚性懸浮細胞進(jìn)行超低溫保存。適宜的保存程序為：取換液后3～5d的胚性懸浮細胞→0.4mol/L的山梨醇液中預培養2d→室溫下60%PVS2預處理15min→0℃下PVS2處理15～20min→迅速投入液氮→40℃水浴快速化凍→1.2mol/L蔗糖+MS基本培養基洗滌→TTC檢測和恢復生長(cháng)。TTC檢測保存細胞的相對存活率高達27.1%。

3、超低溫保存中存在問(wèn)題

3.1 冰凍保護劑

目前使用的冰凍保護劑種類(lèi)很多，按其是否 能滲透到細胞內，可將冰凍保護劑分為兩類(lèi)：一是滲透性冰凍保護劑，包括二甲基亞砜、甘油、乙二 醇、 丙二醇、乙酰胺等，此類(lèi)冰凍保護劑多數為低分子中性物質(zhì)，在溶液中易結合水分子發(fā)生水合作用， 使溶液的粘性增加，弱化了水的結晶過(guò)程，從而起到了保護效果;二是非滲透性冰凍保護劑，包括蔗糖、葡萄糖、聚乙二醇等，這類(lèi)物質(zhì)能溶于水，但不能進(jìn)入細胞，它能使溶液呈過(guò)冷狀態(tài)，從而起到保護作用。

發(fā)現海藻糖能與磷脂相互作用而穩定細胞膜結構，防止冰凍對細胞膜造成直接損傷， 因而它也被用作冰凍保護劑。Bhandal等用海藻糖作*的冰凍保護劑， 成功地保存了胡蘿卜、煙草等細胞培養物。另外，脯氨酸也可作為冰凍保護劑起到穩定凍存細胞中蛋白質(zhì)結構的效果。 實(shí)驗發(fā)現，單獨使用一種冰凍保護劑，其保存效果并不理想，近幾年來(lái)，國內外許多研究都在嘗試采用復合冰凍保護劑。復合冰凍保護劑的 *性在于它能充分發(fā)揮各種成分的保護作用， 從而產(chǎn)生累加效應。10%或5%二甲基亞砜(DMSO)配合一定濃度的甘油或糖，能顯著(zhù)提高超低溫保存后的成活率，而其中糖的種類(lèi)也因保存材料不同而異。

作為冰凍保護劑應具備以下3個(gè)特性：易溶 于水;在適當的濃度范圍內是無(wú)毒的;化凍后易從保存材料中清除。另外， 冰凍保護劑處理應在低溫下進(jìn)行，而且處理時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，一般為20～120min。如桑芽用0.5mol/L山梨糖醇液浸漬過(guò)夜，再用10%DMSO與0.5mol/L山梨糖醇液浸漬處理20min，能顯著(zhù)提高超低溫保存后的 成活率。

3.2 再生植株的遺傳性狀和表型特征的變化

對超低溫保存木瓜的基因 型和表觀(guān)遺傳變化的研究發(fā)現，經(jīng)過(guò)超低溫處理 的再生植株， DNA的甲基化修飾高達6.62%，并檢測到了相應目的條帶。

對超低溫保存的金絲桃再生植株的遺傳和生化特征進(jìn)行分析研究，結果表明處理植株的再生率和染色體數目均具有穩定性，僅在非編碼序列存在微量的突變。

有研究發(fā)現，經(jīng)過(guò)低溫處理的人參在產(chǎn)量方 面未發(fā)生變化;超低溫保存的紫錦蘇組培植株，同對照具有相同的生長(cháng)速率和產(chǎn)品特性。

3.3 超低溫保存中超微結構的變化

研究表明：預培養降低了細 胞的液泡化程度，線(xiàn)粒體嵴變得更為發(fā)達，同時(shí)細胞的代謝活性增加，而未經(jīng)預培養的細胞凍后很 難存活。保護劑處理為超低溫保存的關(guān)鍵環(huán)節，但保護劑處理可造成細胞損傷，從超微結構上 看引起核周隙擴張、膜囊泡化及細胞骨架的塌陷。

在對香蕉莖尖進(jìn)行超低溫保存的過(guò)程中，Heliot等(2003)對保存材料在各個(gè)步驟的超微結構變化進(jìn)行了連續觀(guān)察， 結果表明無(wú)論在冷凍/解凍步驟還是冷凍保護劑處理期間，大部分分生組織細胞都受到損傷，僅位于分生組織圓頂周邊極小范圍內的細胞存活下來(lái)。

4、展望

種質(zhì)資源是產(chǎn)業(yè)安全和可持續發(fā)展的戰略資 源，世界各國十分重視種質(zhì)資源的收集和創(chuàng )新利 用。目前我國果樹(shù)種質(zhì)資源保存的主要手段是圃地保存和組培保存，圃地保存占地大、管理費時(shí)費工，并且受到氣候條件、病蟲(chóng)害等威脅;組培保存存在著(zhù)易感染、費工費電、雜合個(gè)體性狀容易退化、生活力下降等缺點(diǎn)。

超低溫冷凍離體保存能夠彌補以上不足，該方法建立在生物細胞凍害和抗凍機理的基礎上。種質(zhì)超低溫保存成功的關(guān)鍵在于降溫冰凍過(guò)程中避免細胞內結冰，為此，針對不同種類(lèi)的植物材料，篩選適合的冰凍保護劑，采用適當的降溫冰凍速度和化凍方式，可使細胞不受損傷或使損傷減 小到低程度。目前的研究表明， 影響植物材料超低溫保存效果的因素很多，不同的植物或同一 植物的不同材料類(lèi)型，其保存的難易和效果均不同。因此，要根據材料本身的特性，對影響保存的因素進(jìn)行研究，尋找提高超低溫保存成活率和再生率的有效途徑和方法，從而達到成功保存種質(zhì)資源的目的。

目前，超低溫保存技術(shù)的研究大多停留在方法上，供試種質(zhì)材料的保存時(shí)間短，少有長(cháng)期保存再生情況的報道，對離體種質(zhì)保存過(guò)程中遺傳穩定性的研究也很少，研究對象范圍狹窄，而且對同一物種不同品種的研究結果也不盡一致。因此，今后的研究方向一是重點(diǎn)選擇需優(yōu)先保護的瀕危 物種， 用已成熟的技術(shù)進(jìn)行較大規模的中長(cháng)期保存及遺傳穩定性試驗，探討超低溫保存的實(shí)際應用效果;二是對已經(jīng)建立完善再生體系且在生產(chǎn)上具有重要經(jīng)濟價(jià)值的果樹(shù)， 例如櫻桃、核桃、板栗、梨、棗、藍莓等，探索安全簡(jiǎn)便、長(cháng)期穩定的超低溫保存技術(shù)體系。