樣本保存方法及冷凍脅迫對蝗蟲(chóng)基因組DNA提取的影響

以亞洲小車(chē)蝗為研究材料，提出了使用液氮保存蝗蟲(chóng)樣本的有效方法，并用基因組DNA提取試劑盒分別對液氮速凍后保存、直接冷凍、無(wú)水乙醇保存和干制蝗蟲(chóng)標本進(jìn)行了基因組DNA的提取和電泳檢測。

1材料與方法

1.1供試昆蟲(chóng)

本試驗研究的昆蟲(chóng)樣本為亞洲小車(chē)蝗成蟲(chóng)，均采自?xún)让晒佩a林郭勒盟多倫縣農牧交錯區草原，用養蟲(chóng)籠活體帶回實(shí)驗室進(jìn)行處理保存。

1.2液氮速凍處理

取10頭活的亞洲小車(chē)蝗單頭裝入離心管中，將離心管放入液氮中速凍處理3min，取出后在室溫條件下放置12h觀(guān)察亞洲小車(chē)蝗存活情況。

1.3樣本保存方法

1.3.1液氮速凍后保存

將采集帶回實(shí)驗室的活體蝗蟲(chóng)樣本單頭裝入離心管中，將離心管放入液氮中速凍處理3min，取出后放入-40℃冰箱中保存備用。

1.3.2直接冷凍保存

將采集帶回實(shí)驗室的活體蝗蟲(chóng)樣本單頭裝入離心管中，直接放入-40℃冰箱中保存備用。

1.3.3乙醇保存

將采集帶回實(shí)驗室的活體蝗蟲(chóng)樣本放入無(wú)水乙醇(分析純)中保存備用。

1.3.4干制標本

將采集帶回來(lái)的活體亞洲小車(chē)蝗樣本放入毒瓶中毒死后，針插保存于標本室中，待風(fēng)干后進(jìn)行DNA提取試驗。

1.4DNA的提取

將上述4種方法保存的蝗蟲(chóng)樣本在3個(gè)月后進(jìn)行DNA提取試驗。分別選用單頭亞洲小車(chē)蝗的后足股節，無(wú)水乙醇(分析純)保存的蝗蟲(chóng)后足股節需在提取之前先用無(wú)菌去離子水沖洗2～3次，將蝗蟲(chóng)股節放入研缽中用液氮研磨成粉并移入1.5mL離心管中，然后使用天根dp304動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒參照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行基因組DNA提取。

1.5DNA電泳檢測

用1%的瓊脂糖凝膠電泳對提取的蝗蟲(chóng)基因組DNA進(jìn)行檢測。取DNA樣品3μL、上樣緩沖液2μL混勻后加入凝膠時(shí)預留的點(diǎn)樣孔中，加入DL2000Marker(TaKaRa;第3條帶為150ng/μL)，經(jīng)過(guò)100V恒壓電泳20min，使用紫外凝膠成像系統觀(guān)察基因組DNA提取情況并拍照保存。

2結果與分析

2.1液氮速凍處理對樣本保存的影響

液氮速凍處理的10頭亞洲小車(chē)蝗樣本在12h內均無(wú)存活跡象。說(shuō)明通過(guò)液氮速凍處理能夠使亞洲小車(chē)蝗活體樣本迅速死亡，從而消除因逆境脅迫造成的樣本本身生理生化變化，避免了這些變化對蝗蟲(chóng)樣本基因組DNA提取產(chǎn)生可能的不利影響。

2.2不同保存方法對基因組DNA提取影響

亞洲小車(chē)蝗經(jīng)基因組DNA提取后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見(jiàn)圖1～3。液氮速凍后保存和無(wú)水乙醇保存的樣本提取的基因組DNA電泳條帶清晰，說(shuō)明得到的DNA濃度較大;直接冷凍保存的樣本提取的DNA電泳檢測結果顯示條帶整齊，但亮度較低，說(shuō)明得到的DNA濃度較小;蝗蟲(chóng)干標本提取的基因組DNA電泳檢測顯示條帶不清楚，并有明顯拖尾現象，有的甚至看不到條帶，說(shuō)明干制標本保存會(huì )導致蝗蟲(chóng)基因組DNA發(fā)生嚴重降解，會(huì )對下一步基因擴增、分子標記等分子生物學(xué)試驗的進(jìn)行造成不利的影響。

2.3冷凍脅迫對基因組DNA提取影響

對比液氮速凍后保存和直接冷凍保存兩種樣本保存方法對蝗蟲(chóng)基因組DNA提取結果可以看出，液氮速凍后保存的樣本提取的基因組DNA明顯比直接冷凍保存的樣本基因組DNA的電泳條帶亮度高，說(shuō)明液氮速凍后保存得到的DNA的濃度較大。由此得出，樣本在受到冷凍脅迫死亡的過(guò)程中會(huì )發(fā)生基因組DNA降解現象，使提取得到的DNA的濃度較小。所以，液氮速凍后保存更適合昆蟲(chóng)基因組學(xué)的研究。

實(shí)驗結果：在保存3個(gè)月后，檢測蝗蟲(chóng)樣本直接冷凍法和干標本提取的總DNA濃度較低，因而瓊脂糖電泳檢測亮度低;液氮速凍后保存和無(wú)水乙醇保存的蝗蟲(chóng)樣本提取的基因組DNA濃度大。表明液氮速凍后保存和無(wú)水乙醇保存的標本適合用于基因組學(xué)研究。通過(guò)對比，直接冷凍保存與液氮速凍保存結果得出，蝗蟲(chóng)在冷凍脅迫死亡的過(guò)程中有DNA降解發(fā)生。